HOME - ENGLISH
Sâmbătă, 20 Ianuarie 2018 EET
 
print version

Programul:  PN CD III -Program 3 “Cooperare europeană și internațională“/ ERANET

Denumirea proiectului:  Designul rational al unui vaccin terapetic anti HIV-1 bazat pe o formula inovativa de ARNm inglobat in nanoparticule/ Rationally designed therapeutic vaccine against HIV-1 based on a novel formulation of nanoparticle-protected mRNA” (HIV-NANOVA)

 

Comunicari

ENGLISH

BONE MARROW-DERIVED MOUSE DENDRITIC CELLS –AN IN VITRO MODEL FOR THE ASSESSMENT OF mRNA LOADED NANOPARTICLES

 

Ana I. Neagu, Denisa Dragu, Coralia Bleotu, Lilia Matei, Carmen C. Diaconu, Simona Ruta

Stefan S Nicolau Institute of Virology, Bucharest

 

Background: Therapeutic vaccination has emerged as a possible alternative to life-long treatment with antiretroviral drugs in HIV infection. By employing biodegradable nanoparticles loaded with a specific mRNA antigenic HIV sequence and strong mRNA adjuvants, a novel vaccine candidate have been proposed. In this regard, our specific objective was to develop an in vitro model based on bone marrow-derived dendritic cells (BMDC), able to express xenoproteins, in order to prepare for the next step, antigen expression from mRNA conjugated nanoparticles.

Matherials and methods: BMDC were generated from 6-8 week old CD1 strain mice. Cells were initially cultured in two different primary media (M1, M2). Isolated cells, immature and mature BMDC, were morphologically and phenotypically characterised.  The influence of TNF-α and LPS on cell viability was assessed with CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent. Murine dendritic cells mRNA expression capacity was evaluated by transfecting BMDC with PMX-IRES-GFP vector and monitoring GFP flourescence.

Results: Microscopic examination of culture at different growth stages revealed morphological changes in transition from immature to mature BMDC. Following maturation, an increased level of expression of CD80, CD86 and CMH II was observed. Analysis by flow cytometry confirmed a homogenous cell population, with a percentage of CD11c over 50% for both primary media, and a low percentage of exclusion markers CD3, CD19, CD49b. Irrespective of the primary medium used, immature cells expressed low levels of co-stimulatory molecules CD86, whose expression raised after LPS and TNF-α stimulation. CD115 expression was similar for both primary media used, and decreased during  maturation. The results of cell proliferation/viability assay showed a decrease of cell viability in LPS and TNF-α stimulated cells at 72 hours. The ability to express xenoproteins was assessed by transfecting a GFP expressing retroviral vector (pMX-IRES-GFP). GFP expression was monitored by assessing GFP fluorescence. Conclusion. We established in our laboratory an experimental model of bone marrow-derived murine dendritic cells cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 and stimulated with LPS or TNF-α, able to express an exogenous protein.

ROMANA

CELULELE DENDRITICE MURINE DERIVATE DIN MĂDUVA OSOASĂ HEMATOGENĂ – MODEL IN VITRO PENTRU EVALUAREA NANOPARTICULELOR ÎNCĂRCATE CU mRNA

Ana I. Neagu, Denisa Dragu, Coralia Bleotu, Lilia Matei, Carmen C. Diaconu, Simona Ruta

Stefan S Nicolau Institute of Virology, Bucharest

 

Introducere: Vaccinarea terapeutică a apărut ca o alternativă posibilă la terapia de lungă durată cu medicamente antiretrovirale în infecția HIV. A fost propus un nou vaccin bazat pe folosirea unor nanoparticule biodegradabile încărcate cu o secvență antigenică specifică de ARNm HIV și adjuvanți potenți ARNm. În acest sens, obiectivul nostru specific a fost dezvoltarea unui model in vitro bazat pe celule dendritice murine derivate din măduva osoasă hematogenă (BMDC), capabil să exprime xenoproteine, ca o etapă preliminară în analiza expresiei antigenice utilizând nanoparticule conjugate cu mARN

Materiale și metode: BMDC au fost generate prin izolarea celulelor din maduva hematogenă la șoareci CD1 de 6-8 săptămâni. Celulele au fost cultivate inițial în două medii primare diferite (M1, M2). Celulele izolate, celulele dendritice imature și mature, au fost caracterizate morfologic și fenotipic. Influența TNF-α și LPS asupra viabilității celulare a fost evaluată cu CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent. Capacitatea de expresie a mARN de către celulelor dendritice murine a fost evaluată prin transfecția BMDC cu vectorul PMX-IRES-GFP și monitorizarea fluorescenței GFP.

Rezultate: Examinarea microscopică a culturii în diferite stadii de creștere a arătat modificări morfologice în tranziția de la BMDC imature la BMDC mature. Ca rezultat al maturării, s-a observat un nivel crescut de expresie a CD80, CD86 și CMH II. Analiza prin citometrie în flux a confirmat existența unei populații celulare omogene, cu un procent de CD11c peste 50% pentru ambele medii primare, și un procent scăzut de markeri de excludere CD3, CD19, CD49b. Indiferent de mediul primar utilizat, celulele imature au exprimat un nivel scăzut de molecule co-stimulatorii CD86, a căror expresie a crescut după stimularea cu LPS și TNF-α. Expresia CD115 a fost similară pentru ambele medii primare utilizate, și a scăzut în timpul maturării. Testul de viabilitate/ proliferare celulară a arătat o scădere a viabilității celulare în celulele stimulate cu LPS și TNF-α la 72 de ore. Capacitatea de a exprima xenoproteine a fost evaluată prin transfecția unui vectorul retroviral care exprimă GFP (pMX-IRES-GFP). Expresia GFP a fost monitorizată prin evaluarea fluorescenței GFP. Concluzie. Este disponibil un model experimental de celule dendritice murine derivate din măduva osoasă hematogenă cultivate în prezența GM-CSF și IL-4 și stimulate cu LPS sau TNF-α, capabil să exprime o proteină exogenă.

BACK

 

RO EN