HOME - ENGLISH
Marţi, 23 Octombrie 2018 EET
 
print version

Grupul de Bioinformatica si Hardware

Contract nr. 11-034/2007

Sisteme nanostructurate pentru identificarea de antigene virale cu utilizari in diagnosticul medical

Activitati si rezultate

ETAPA I
sept 2007 – dec 2007
Selectarea sistemelor pentru detectia legaturilor liganzilor la receptori specifici în sisteme nanostructurate

Rezumat

A fost stabilit suportul teoretic si metodologic prin alcatuirea unei documentari stiintifice de actualitate centrate pe diagnosticul serologic al unor agenti patogeni virali. În acest sens a fost redactata o scurta trecere în revista a aspectelor esentiale ale relatiei antigen-anticorp în ceea ce priveste structura si parametrii  fenomenului de recunoastere a epitopilor de catre situsul combinativ al anticorpilor. Au fost comentate proprietatile de afinitate, aviditate, specificitate si modul de evidentiere a complexului imun realizat (precipitare, aglutinare, sau marcare a anticorpilor cu fluorocromi, izotopi radioactivi, enzime).   

Au fost evaluate performantele si limitele tehnicilor existente în prezent si perspectivele de aplicare a unor procedee moderne care sa creasca calitatile de sensibilitate, specificitate si economicitate ale acestor tehnici. Astfel,au fost prezentate succint reactiile de hemaglutinoinhibare(HI); de fixare a complementului (RFC); de seroneutralizare (RSN); imunofluorescenta (IF); tehnici microscopice imunoenzimatice; tehnici imunoenzimatice (ELISA); tehnica Radioimunologica (RIA); flow citometria si a fost formulata aprecierea critica a performantelor si limitelor fiecareia. În acest sens au fost definite criteriile  de selectivitate, specificitate, valoarea predictiv pozitiva (VPP) si  valoarea predictiv negativa (VPN).

Aceasta sinteza a stat la baza evaluarii oportunitatii, necesitatii si fezabilitatii temei de cercetare privind aplicabilitatea si avantajele introducerii în tehnicile de diagnostic serologic viral a metodelor de detectie cu cristale lichide si sisteme nanostructurate. A fost realizat un studiu documentar privind aplicabilitatea si perspectivele utilizarii în domeniul diagnosticului de laborator si al cercetarii stiintifice a „cristalelor lichide” si a unor „sisteme nanostructurate” sisteme care au o dezvoltare si extindere semnificativa pe plan mondial.

Au fost stabilite grupele de virusuri, cu pondere în patologia infectioasa umana, pentru care este prevazuta cercetarea metodelor de detectie cu  sisteme de Cristale lichide (LC): virusul hepatitei B (HBV), virusul citomegalic uman (HCMV), virusul Epstein-Barr (EBV) si virusurile papiloma umane (HPV). Nu au fost eliminate posibilitatile utilizarii si a altor tipuri de virusuri. Pentru acesti agenti patogeni sunt disponibile în uz curent metodele de detectie ale antigenelor virale, a anticorpilor specifici si a detectiei genomului viral (izolare, cultivare, IF, ELISA, PCR, sa.)

Au fost selectati pe criterii legate de structura moleculara si a caracteristicilor fizico-chimice si au fost achizitionati reactantii (disponibili commercial) propusi pentru includerea în stratul SAM (monostrat autoasamblat) în vederea functionalizarii acestuia cu: antigene virale: Epstein-Barr Virus HHV-4 p23 (recombinant protein antigen); citomegalovirus uman HCMV Pp65 (UL83) (protein recombinant antigen); virusul hepatitei B HBV HBs (surface antigen); anticorpi: anticorpi monoclonali anti HBs; anticorpi monoclonali anti p23 EBV; Anticorpi monoclonali anti pp65 HCMV; biotina B4501 Sigma; anti-biotin-FITC conjugated; avidina; ser imun anti IgG conjugat cu fluorocrom; suport solid: Lame salinizate S4651Sigma.

Pentru realizarea sistemului de detectie cu LC s-a efectuat: alegerea sistemului SAM în vederea utilizarii ca biosensor (compusi aminoalkanethiol, N-FMOC aminoalkanethiol, compusi carboxyalkanethiol, carboxyalkanethiol, compusi ferrocenylalkanethiol, hydroxyalkanethiol, compusi succinimidyl alkanedisulfid sa);  corelarea structurii la scara moleculara a SAM cu performantele potentiale ca biosensori în diagnosticul virusologic; testarea  interactiunii potentiale a SAM cu antigenele si anticorpii selectati pentru evidentierea unor posibile efecte de modificare chimica si structurala ce pot afecta  afinitatea si specificitatii acestora.

Pentru aceasta etapa, dupa ce au fost cercetate datele accesibile din literature de specialitate, au fost concepute teste privind realizarea contactului  reagentilor cu SAM (concentratii si timp variabil). A fost evaluata si testarea reactivitatii si specificitatii acestor reagenti prin tehnicile uzuale.

Formarea compusilor de incluziune ai ciclodextrinelor (CD) cu numeroase substante oaspete este o metoda eficienta de “încapsulare moleculara”. În prezent CD sunt folosite în nanotehnologii ca nanoreactoare, nanoprotectori, nanocapsule, agenti de eliberare a medicamentelor la nivel nanometric si pentru recunoasterea aminoacizilor. Alaturi de evidentierea interactiunilor ligand-receptor (antigen-anticorp) prin tehnicile de vizualizare cu LC sau cele bazate pe nanoparticule functionalizate, în proiectul de fata se propune o noua directie - includerea (“încapsularea moleculara”) compusilor bioactivi pentru diagnosticul medical în nanocavitatile ciclodextrinelor (CD) si ale derivatilor lor reactivi si respectiv eliberarea/interactiunea lor ulterioara controlata cu substantele din mediul de testare.

În urma analizei literaturii si a unor studii preliminare proprii, s-au propus urmatoarele strategii experimentale:

1. Compusi de incluziune ai β-CD - Pelicule fotopolimere cu biotina si β-CD depuse pe diferite suporturi (sticla, cuart etc.).
2. Compusi de incluziune ai MCT- β-CD.
2.1. Monostraturi autoasamblate (SAM) cu biotina si MCT-β-CD pe suporturi cu straturi de aliniere de aur.
2.2. Pelicule fotopolimere cu biotina si MCT-β-CD pe baza de SAM pe suporturi cu straturi de aliniere (aur sau SiOx).
2.3. Pelicule fotopolimerice cu biotina cu/fara MCT- β-CD depuse pe sticla, cuart, fluorura de litiu, KRS-5 fara straturi de aliniere ( Au sau SiOx).
2.4.Metode spectroscopice de analiza a interactiunii avidina – biotina (FT-IR,. FT-IR-ATR,. UV-VIZ-NIR, analiza prin fluorescenta).

RO EN