HOME - ENGLISH
Sâmbătă, 20 Ianuarie 2018 EET
 
print version

 

 

SISTEME NANOSTRUCTURATE PENTRU IDENTIFICAREA DE ANTIGENE VIRALE CU UTILIZARI IN DIAGNOSTICUL MEDICAL

Contract VIRNANO nr. D1-11034/2007

 

Etapa 1

 

Prima etapă a acestui proiect, intitulată „Selectarea sistemelor pentru detecÅ£ia legăturilor liganzilor la receptori specifici în sisteme nanostructurate” îşi propune trecerea succintă în revistă a literaturii privind:

a) metodele actuale de identificare a agentilor patogeni;

b) realizarea unei noi metode de identificare a agentilor patogeni prin elaborarea unui sistem cu topografie controlata care sa permita evidentierea intractiilor specifice antigen-anticorp si vizualizarea acestei interactii pe baza fenomenului de amplificare cu ajutorul cristalelor lichide;

c) chimia ÅŸi aplicaÅ£iile ciclodextrinelor ÅŸi ale derivaÅ£ilor acestora pentru studiul interacÅ£iunilor biotină-avidină ca model pentru cele antigen-anticorp.

Dintre metodele cunoscute in prezent pentru identificarea agentilor patogeni sunt prezentate critic cateva dintre cele mai uzuale.

Apoi sunt analizate si prezentate mai multe variante ale unui sistem de detectie alcatuit dintr-un suport solid avand suprafata cu geometrie controlata sau cu suprafata functionalizata prin depunerea unor straturi organice auto-asamblate (SAM) pe care se ancoreaza cu ajutorul unor ciclodextrine sau al unor derivati ai acestora structurile de recunoastere pentru diferite proteine de suprafata caracteristice pentru anumite virusuri umane.

Alături de evidenÅ£ierea interacÅ£iunilor ligand-receptor (antigen-anticorp) printehnicile de vizualizare cu cristale lichide (CL) sau cele bazate pe nanoparticule funcÅ£ionalizate, în proiectul de faţă se propune o nouă direcÅ£ie - includerea (“încapsularea moleculară”) compuÅŸilor bioactivi pentru diagnosticul medical în nanocavităţile ciclodextrinelor (CD) ÅŸi ale derivaÅ£ilor lor reactivi ÅŸi respectiv eliberarea/interacÅ£iunea lor ulterioară controlată cu substanÅ£ele din mediul de testare.

În urma analizei literaturii şi a unor studii preliminare proprii, s-au propus următoarele strategii experimentale:

Evidentierea reactiei antigen-anticorp in doua moduri:

a)     utilizarea metodelor clasice prezentate in prima parte a prezentului referat;

b) utilizarea uneia dintre variantele de dispozitiv obtinute in cadrul prezentului proiect, conform propunerilor de strategii experimentale prezentate mai jos

                Varianta 1 SISTEM SI METODA pentru partenerii P1, P2, P3

SISTEM: Monostraturi autoasamblate (SAM) cu biotină ÅŸi MCT-β-CD pe suporturi cu straturi de aliniere de aur

A. SAM depuse pe plăci de sticlă cu straturi de aliniere de aur cu derivati tiolici (alchiltioli, hidroxitioli, derivati tiolati ai MCT-β-CD) (Partenerii P2 ÅŸi P3)

                B. SAM depuse pe plăci de sticlă cu straturi de aliniere de aur tratate cu acid sialic, poli-L-lizina

- Schimbarea orientarii CL demonstrează prezenÅ£a interacÅ£iunii biotină – avidină.

      - MenÅ£inerea orientării CL demonstrează lipsa interacÅ£iunii biotină - avidină, deci cea din urmă nu a fost reÅ£inută pe peliculă

                   Varianta 2 SISTEM SI METODA pentru partenerul P3

   SISTEM: Pelicule fotopolimerice cu biotină, cu/fărăMCT-β-CDdepuse pe sticlă, cuarÅ£, fluorură de litiu, KRS-5 fără straturi de aliniere (Au sau SiOx)

                A. Cu preiradiere ÅŸi fără MCT- β-CD

B. Cu preiradierea polimerului ÅŸi cu MCT- β-CD

- Schimbarea orientarii CL demonstrează prezenţa interacţiunii între biotină şi avidină

- Menţinerea orientării CL arată absenţa interacţiunii biotină - avidină deci cea din urma nu a fost reţinută pe peliculă.

Metode spectroscopice de analiză pentru componentele sistemului proiectat:  FT-IR – transmisie în lumină nepolarizată ÅŸi polarizată,  FT-IR-ATR ÅŸi FT-IR-reflexie speculară în lumină nepolarizată ÅŸi polarizat, UV-VIZ prin transmisie, UV-VIZ-NIR prin reflexie difuză cu sferă integratoare, analiză prin fluorescenţă.

 A fost efectuata o cautare in PDB a structurilor proteice de interes care vor fi necesare in faza de modelare moleculara.

 

Etapa 2

Dezvoltarea de modele experimentale bazate pe cristale lichide si ciclodextrine pentru stabilirea posibilitatilor de decelare a interactiunilor specifice ligand-receptor

   A fost descrisa o tehnica de depunere in vid pentru un strat subtire de aur, la unghi de incidenta mic) pentru obtinerea de placute de sticla utilizate la formarea celulelor de masurare optica.

  S-a optimizat tehnica de depunere in vid, prin stabilirea conditiilor de depunere in functie de dimensiunile placutelor de sticla si a unghiului de evaporare.

Cu ajutorul nomogramelor, a fost descrisa o metoda de analiza pentru alegerea conditiilor de depunere in vid.

A fost elaborata o reteta de laborator pentru curatarea suportului de sticla pe care se depune stratul de aur. Pe sticla de tip ROTH, s-au depus straturi de Cr/Au folosind tehnica de depunere in vid, utilizand instalatia de depunere Eduards AUTO500, cu sistem de pompe turbomoleculare, la vid de 10-6 torr. Straturi de Cr/Au au fost caracterizate cu AFM si SEM, realizandu-se si masuratori interferometrice.

Pentru cresterea aderentei stratului de aur la suprafata suportului din sticla, s-a utilizat un strat intermediar de polistiren, depus prin spin-coating.

S-au realizat celule cu cristal lichid (celule de masurare) de diferite tipuri, luand in considerare continutul stratului depus pe suportul de sticla, unghiul de depunere al stratului de Au` si grosimea stratului depus.

S-a adaptat metoda conoscopica pentru determinarea gradului de aliniere a cristalului lichid in celulele experimentale.

S-a evidentiat ca metoda SERS de studiu constituie o procedura de identificare a legarii alcantiolului de aurul depus pe suprafata suportului din celula de analiza.

Au fost folosite mai multe metode de punere in evidenta a orientarii cristalelor lichide si de studiu a structurii straturilor depuse: vizualizare directa, conoscopie, difractie de raze X, reflectometrie de raze X, microscopie de forta atomica, spectroscopie de fotoelectroni, spectroelipsometrie.

S-au stabilit doua metode si procedee de obtinere a straturilor de tip SAM, elaborand strategia de abordare a cercetarilor pentru identificarea si selectionarea componentelor constitutive, precum si stabilirea conditiilor de operare privind realizarea si aplicarea acestora pe suporturi din sticla pe care sunt depuse filme din aur.

Au fost obtinute un numar de noua straturi autoasamblate (SAM), din care trei pe baza de alcantioli, doua pe baza de compusi de incluziune ai ciclodextrinei si derivatilor reactivi ai acesteia, doua SAM-uri mixte si cate un SAM pe baza de poli-L-lizina si respectiv acid sialic. Structurile obtinute experimental au fost caracterizate fizico-chimic.

S-a elaborat un studiu de modelare (model matematic) si simulare a procesului de grefare a monoclorotriazinil-β-ciclodextrinei pe suporturi celulozice (celofan si bumbac), prin aplicarea metodelor de programare factoriala si centrala rotabila compusa, in scopul obtinerii unei relatii cantitative si calitative referitoare la parametri semnificativi care influenteaza procesul.

Au fost obtinuti si purificati compusi de incluziune ai β-ciclodextrinei (β-CD) si monoclorotriazinil-β-ciclodextrinei (MCT-β-CD) cu substante bioactive (biotina), structurile proiectate fiind confirmate prin analiza spectrala FT-IR in transmisie.

 

Etapa 3

Prezentarea şi optimizarea modelelor experimentale propuse în scopul evidenţierii unor complecşi moleculari

 

REZUMAT

            Au fost realizate sisteme de aur (Cr-Au) nanostructurat pe suport de sticla, cu depuneri de PMMA. Structurile realizate experimental au fost vizualizate prin SEM, observandu-se un chip cu patru nanostructuri. Prin difractie de raze X au fost caracterizate filme subtiri de aur pe substraturi diferite (Si, PS, Si poros, sticla). Din datele de reflectivitate s-a determinat variatia rugozitatii functie de grosimea filmului de aur depus.

            Au fost stabilite conditiile optime de realizare a straturilor autoasamblate. Acestea au implicat depunerea de tioli pe 3 tipuri de straturi: straturi de aur depuse pe suport de sticla, straturi de aur depuse pe suport de sticla acoperita cu polistiren, sticla. Au fost obtinute structuri moleculare functionalizate pe strat de sticla silanizata cu 2 aminosilani: (3-aminopropil) trietoxisilan si [3(2-aminoetil) aminopropil] trimetoxisilan; utilizarea celui de-al doilea aminosilan pentru functionalizarea sticlei nu este citata in literatura de specialitate. Sinteza unui tiol, cu structura originala, a fost realizata prin reactia dintre monoclortriazinil-β-ciclodextrina (sare de sodiu) si 11-mercaptoundecanamina. S-a facut caracterizarea fizico-chimica a 28 de structuri moleculare realizate, din care 4 au fost verificate in protocolul uzual de evidentiere a interactiunii ligand-receptor cu izotiocianat de fluoresceina.

Caracterizarea compusilor CI ai β-CD ÅŸi MCT- β-CD cu biotină s-a efectuat prin spectroscopie UV-VIS, analiză termică si probe de solubilitate. ÃŽn urma analizei termice, se observă că mecanismul de degradare a martorilor ÅŸi a compuÅŸilor de incluziune este complex ÅŸi se desfăşoară în două până la cinci etape. Degradarea nu este completă, rămânând cantităţi diferite de reziduu. Valorile apropiate ale energiilor de activare ÅŸi a ordinelor de reacÅ£ie obÅ£inute la viteza de încălzire de 10°C, confirmă faptul că mecanismul de degradare a compuÅŸilor de incluziune cu biotină este asemănător. ProduÅŸii studiaÅ£i nu vor fi afectaÅ£i de solicitările termice din timpul tratamentelor de grefare, complexare, solublizare, spălare, uscare. Cunoasterea solubilităţii gazdelor si a compuÅŸilor de incluziune cu biotina este necesară (in special pentru MCT- β-CD si MCT- β-CD- biotina) pentru realizarea practică a unor pelicule polimere reactive. In studiile ulterioare se recomanda ca solubilizarea acestor substante sa se faca in apa, DMSO si DMF.

Pentru evidentierea interactiunilor de tip biotina-avidina au fost folosite mai multe tipuri de suporturi. Acestea constau din lame de sticla tratate dinferit (filme de Cr-Au, SiOx la unghi de 60° sau 82°, polistiren). Au mai fost utilizate lame de sticla tratate cu APES, AEAPES (5-10%) sau cistamina. Determinarile au fost efectuate prin observarea probelor la microscopul de fluorescenta si captarea imaginilor cu o camera de luat vederi. S-a pus la punct o metoda numerica de procesare a imaginilor de microscopie, pentru evidentierea interactiunilor specifice si a celor nespecifice.

In vederea realizarii celulelor de proba, au fost realizate urmatoarele tratamente aplicate placi de sticla: curatirea sticlei, depunere de SiOx la unghi de 60 o fata de normala la suprafata (mic fata de suprafata) si grosime aprox. 25 nm; depunere de polistiren prin spin coating; depunere de aur la unghi mic (fata de suprafata); depunere de alcool polivinilic prin spin coating; tratare cu alcantioli; tratare in plasma de oxigen; tratare cu amida (DSS); tratare cu amina (APES); tratare cu albumina (BSA). Aceste tratamente s-au aplicat pe rand, partial sau in totalitate. De aceea, au rezultat multe tipuri de placi de sticla. Cu placile depuse mai sus, au fost realizate celule cu cristal lichid care sa permita observarea orientarii cristalului lichid in urma interactiei cu diferitele substraturi. Au fost obtinute si alte tipuri de celule cu cristal lichid, pentru observare/testare, a complecsilor moleculari pentru o serie de placute cu substrat nanostructurat, in care functionalizarea s-a facut pe portiuni diferite ale placutelor (depuneri/reactii in picatura). Pentru celulele formate cu placute cu depuneri/reactii in picatura, au fost facute placute pereche cu alcoolpolivinilic frecat, care permitea o aliniere binecunoscuta. Astfel s-au putut pune in evidenta orientari/dzorientari datorate diferitelor portiuni din celula.

In toate cazurile de mai sus, identificarea prezentei complecsilor moleculari s-a facut prin observarea comportarii celulelor cu cristal lichid prin metode specifice: vizualizare directa in lumina polarizata, conoscopic, cu inregistrarea imaginilor cu camera de luat vederi a ansamplului experimental. Observatiile s-au facut la temperatura camerei. In acest fel, au fost realizate numeroase fotografii care urmareau observarea la microscop a gradului de dezordine indus de complecsii moleculari in celulele de testare.

            Au fost adaptate si optimizate tehnici de depunere de straturi subtiri in vid pentru obtinerea de suprafete cu topografie controlata de SiOx, ceea ce reprezinta o extindere fata de rezultatele fazelor precedente. S-a folosit tot tehnica depunerii la unghi mic. A fost experimentata si functionalizarea prin depuneri in plasma. Aceasta a condus la hidroxilarea straturilor superficiale si depunerea unor grupari reactive.

Au fost folosite metode aditionale, spectroscopice, pentru urmarirea formarii staturilor de functionalizare si a complecsilor moleculari: spectroscopie IR de reflexie, spectroscopie de fluorescenta in domeniul UV. Spectrele de reflexie au fost prelucrate prin aplicarea relatiilor Kramers Kronig, in vederea extragerii informatiilor privind spectrul de absorbtie datorat componentelor straturilor depuse pe sticla. Aceste spectre au fost atribuite, cea ce a permis interpretarea depunerilor realizate. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RO EN